Trong một chuyến đi đến Nam Âu, Nicholas đã bị ốm nhưng bệnh tình của ông lúc đầu không được chuẩn đoán chính sát bởi nền y học lúc đó các triệu chứng bao gồm đau lưng và cổ, nhạy cảm với tiếng ồn và ánh sáng.[6] Vì được chuẩn đoán là chỉ mắc bệnh thấp khớp nên Nicholas đã tiếp tục chuyến đi của mình kéo dài đến Ý, tại đây sức khỏe của ông dần trở nên tồi tệ và được chuyển đến Pháp để điều trị nhưng cũng không thể cải thiện được tình trạng đang ngày một nghiêm trọng của ông và các bác sĩ cuối cùng đã chuẩn đoán ông bị viêm màng não tủy, và ông qua đời vào ngày 24 tháng 4 năm 1865, tại Villa Bermond ở Nice, nước Pháp. Một năm trước khi qua đời, vào mùa hè năm 1864, Nicholas đã đính hôn với Công chúa Dagmar của Đan Mạch con gái của vua Christian IX của Đan Mạch và Vương hậu Louise của Hesse-Kassel.[7] Cuộc hôn nhân này cuối cùng đã được thay thế bởi Alexander như theo nguyện vọng của Nicholas đã bày tỏ với Công chúa Dagmar, ước muốn rằng em trai ông Alexander, người mà ông luôn tin rằng tốt bụng và lương thiện sẽ trở thành chồng của Công chúa Dagmar sau cái chết của ông.[8][9]

Sự ra đi của Nicholas đã khiến mẹ ông suy sụp hoàn toàn, gia đình Hoàng gia được cho là đã có mặt đầy đủ quây quần bên giường bệnh vào giây phút Nicholas ra đi. Hai năm sau khi mất, năm 1867, tại nơi ông mất một nhà nguyện mới ở Thành phố Nice tên là Nhà nguyện Tsarevich Nicolas Alexandrovitch được xây dựng và khánh thành năm 1868 để tưởng nhớ đến Nicholas Alexandrovich của Nga .[10]